学生时代最为憧憬的分子生物学技术是对基因进行任意的点突变，制造带有特定突变的蛋白质。以研究public health里最为关注的基因-环境交互作用。基因/蛋白质的定点突变技术和蛋白质分子动力学模拟正好可以相互佐证。
■(细胞外)对Plasmid的Site Directed Mutagenesis(SDM)
高保真(如PFU酶)PCR法对整个质粒进行扩增(模板质粒需来自于dam+的大肠杆菌，如DH5α、JM109)，通过引物可以很方便地引入特定的点突变。PCR后，模板质粒通过甲基化敏感的内切酶(如Dpnl)除去。新的质粒转化大肠杆菌，并扩增，筛选克隆。最后通过酶切、测序确认SDM效果。具体理论可以阅读https://blog.addgene.org/site-directed-mutagenesis-by-pcr 里面提到PCR赋值后的(绿色)可能是线性的。
所以关键在于设计primer。以NEB的Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit为例:
另一种重叠PCR法的substitution引物设计:
以GCG→ACG为例： 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’
- 首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’
(两个引物不一定反向互补，只要突变位点两边各自有至少12个碱基) - 引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。
- 重新调整引物长度。
Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’
Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’
在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。
此类方法也可以引用Indel，只不过成功率稍低，不如点突变几乎100%。
■(细胞内)对基因组的Genome editing
CRISPR技术人为引入DNA双链损伤，继而引发细胞内在的同源重组修复 (HR)机制，在导入的模板指导下，实现Substitution, Indel。但难度不一，deletion最为方便(特指以实现基因敲出为目的的核苷酸deletion)，substitution有难度。原因是人工引入DNA损伤后，HR和NHEJ并存，优先级不同，而后者不依赖模板。
更多知识阅读https://blog.addgene.org/crispr-101-homology-directed-repair
