蛋白质-DNA互作和蛋白质-蛋白质互作实验方法

2015-09-20

总结一下研究蛋白质-DNA互作和蛋白作用的实验方法。ChIP部分是前段时间培训时所记录。

1.EMSA (electrophoretic mobility shift assay)

基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。在电场中，DNA分子向正极移动距离的大小与其分子量(的对数)成反比。结合蛋白质的DNA，分子量加大，在凝胶中的迁移会受到阻滞，移动的距离相应缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带。

2.ChIP (Chromatin immunoprecipitation)

注意对照设置!!!

2.1. Target

三种可与DNA结合的蛋白，Histone|TF|Co-factor。它们与DNA的结合力不同而处理方式不同

Protein-DNA binding affinity; Histone容易pull down，TF不容易
Signal/Noise ratio

2.2.ChIP

cross-link
chromatin shearing: MNase-based Ch fragment and Sonication-based Ch fragment
key: DNA片段，染色质保护好；1% Agarose gel只看DNA，看不到Protein
- Histone: Sonication better, MNase also good
- TF: MNase better (Sonication shearing may lost protein)
- Co-factor: MNase better (Sonication shearing may lost protein)
IP: Ab: input, IgG, IP三个, over night; bead: 4℃

2.3. qPCR

key: SYBR green method and Tagman probe method are different; 有时适当降低template和退火温度。
普通PCR中的内参在此处换为input
Primer design:
- Target fwd/rev primer: 2000bp ~ -300bp; 500bp~-100bp。TF: 测motif,从promoter上找。若没有motif，可以从MEME上预测
- Input control: normalization作用; 实验组 x% of input, IgG x% of input; 判断实验是否可信。每一对primer要有自己的input组
- IgG negative control: any primer
- H3 positive control: any primer
- NA loci control: 已知基因; positive/negative
PCR (20ul reaction)
- Replicates: three times (三次重复都不稳定的话，说明模板DNA量太少了)
- NTC no template control:
- SYBR green method, melting curve: peak的位置(PCR产物长度)和大小(PCR产物量)
Standard of a good ChIP-PCR
- Absolute value: % input
  Positive H3, >1%; Negative IgG, <0.1%; Histone, 1-50%; TF/cofactor, 0.2-1%
- Relative value: signal to noise ration
  ChIP signal/IgG signal 8-10 times; ChIP signal/Negative loci signal: 3-5 times
Calculation of ChIP signal: (%input)
if single input is used: % input=2%*2^(CTinput-CTsamle); if input standard curve is used: linear regression (slope)

2.4. Sequencing

Prepare DNA library
PCR amplification: 尽量多template DNA，少的PCR
Setup:
sample: 3 repeats
negative control: Input better, IgG (理论上是最好的control,但拉不下来)
positive control:
Data analysis

3.Y2H (Yeast two-hybrid screening)

酵母转录因子GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域.

位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）
位于C端768-881 位氨基酸残基区段的转录激活域（Activation domain,AD)

DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence,UAS)，并与之结合. 而AD则是通过与转录机构（transcriptionmachinery）中的其他成分之间的结合作用，以启动UAS下游的基因进行转录。

DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，使启动子下游基因得到转录。

4.CoIP (Co-Immunoprecipitation)

起源于抗原抗体结合的IP技术。如果蛋白X与蛋白Y结合(CoIP不能区分直接还是间接结合!!!，但保持天然状态)，那么用抗体结合蛋白X时，蛋白Y也被拉下来；反之亦然。基本步骤是，首先提取蛋白，然后在提取液中加入蛋白X的抗体，孵育后再加入Protein A或G(包被在Agarose 或magnetic beads等介质上，用于分离)，最后形成”Y-X-抗X-ProteinA/G beads”复合物。然后聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过Western Blot检测蛋白Y。也可以直接将沉淀下来的蛋白进行质谱分析。

有人总结的很好:

1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；
2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；
3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；
4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；
5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；
6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员;

5.GST Pull-down

基本原理是将”靶蛋白-GST融合蛋白”亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”。目的蛋白溶液过柱，其中“捕获蛋白”(目的蛋白)可以被捕获。洗脱后通过WB或者质谱进行检测和鉴定。(Pull-down不能保持天然状态!!!，但能反映直接结合!!!)